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第二章基因工程操作的工具酶10315www.0977744.com

发布日期:2019-09-23 05:00   来源:未知   阅读:

  第二章基因工程操作的工具酶10315_幼儿读物_幼儿教育_教育专区。第二章 基因工程操作的工 具酶 2.1 基因工程工具酶 1.工具酶的概念 2.限制性内切酶 3.DNA聚合酶 4 DNA连接酶 5.碱性磷酸酶 6 末端转移酶 7 核酸酶S1 8 T4多核苷酸

  第二章 基因工程操作的工 具酶 2.1 基因工程工具酶 1.工具酶的概念 2.限制性内切酶 3.DNA聚合酶 4 DNA连接酶 5.碱性磷酸酶 6 末端转移酶 7 核酸酶S1 8 T4多核苷酸激酶 1.工具酶的概念 应用与基因工程的各种酶的总称. 切: 连: 修饰: 2.限制性内切酶 主要从细菌中分离得到,核酸水解酶。酶识 别特定的核苷酸顺序,但在细菌本身的 DNA中,这些顺序已被甲基化修饰,因而 不被水解;这些酶仅限于水解外源DNA以 保护自身,故称之为“限制性”酶。 以内切方式水解DNA,产物的5’为p, 3’ 为 OH。 限制性内切酶的发现 Luria和Human发现: λ.K噬菌体 ---------------Ecoli λ.B噬菌体---------------- Ecoli 广泛存在于原核细菌 。 由宿主控制的对外源DNA的限制(restriction) 和对内源DNA的修饰(modification)现象称 为宿主细胞的限制和修饰作用。 作用: 一:保护自身DNA不受限制; 二:破坏入侵的外源DNA,使之降解。 Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一 种酶,能够特异性的切割DNA,这个酶被 命名为Hind I,这是第一个分离到的限制性 内切核酸酶。 限制性内切酶的定义 指限制修饰系统中的一个组成部分,具有识别 双链DNA分子中的某种特定核酸序列,并由 此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切 酶。 限制性内切酶分类 根据限制性内切酶的识别顺序与切割位置是 否一致,将它们分成三类。 Ⅰ型型限制性内切酶: Ⅱ 型限制性内切酶: Ⅲ型限制性内切酶: I型限制性核酸内切酶具有核酸内切酶、甲基化 酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性,其切割 作用是随机进行的,一般在距离识别位点上 千碱基对以外的随机位置上切割,不产生特 异片段。 Ⅲ型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白 质复合物,具有限制与修饰双重作用。 切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处,无 序列特异性,只与识别位点的距离有关,而且 不同酶的这一距离不同 。 Ⅱ 型限制性内切酶: 3个基本的特征: ① 在 DNA 分 子 双 链 的 特 异 性 识 别 序列 部位 切 割 DNA分子;识别序列的碱基数一般为4、6、8个 bp,识别位点经常是一种回文序列的DNA. 限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸,这些序列大多呈回纹结构。 Eco RⅠ识别6个核苷酸序列,www498888com开马,在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’ Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’ SmaⅠ酶切 5’ … C – C– C↓ G–G – G … 3’ 3’ … G – G–G↑ C– C – C… 5’ BalⅠ酶切识别6个核苷酸的序列,在特定的 G-C之间切割DNA分子: 5’ … T – G– G↓ C–C – A … 3’ 3’ … G – A–C ↑ G–G – T… 5’ ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常 不是彼此直接相对的; Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’ ③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的 单链延伸末端。 EcoRⅠ: 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’ 限制性核酸内切酶的命名 按酶来源菌的属、种名而定,取属名的第一个 字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母 作略语表示;如有株名,再加上一个字母,其 后再按发现的先后写上罗马数字。例如:从流 感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae d) 中先后分离到3 种限制酶, 则分别命名为 HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。 常见的限制性内切酶 限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 EcoR Ⅰ G↓AATTC HindⅡ GTPy↓PuAC Hind Ⅲ A↓AGCTT BsuR I GG↓CC Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ CTGCA↓G CCC↓GGG T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC GC↓GGCCGC ? 5’ –GAATTC-3’ EcoRI G AATTC 5 ’ 粘端 ? 3 ’ – CTTAAG-5 ’ CTTAA G ? 5 ’ – CTC GAG-3’ Pst I CTCGA G ? 3 ’ – GAG CTC-5 ’ G AGCTC 3 ’ 粘端 ? 5 ’ – CCC GGG-3’ Sma I CCC GGG 平末端 ? 3 ’ – GGG CCC-5 ’ GGG CCC 限制酶产生末端的连接 a、粘性末端互补 ? -CTCGAAGCTTGTTC- - GGCAAGCTTACT- ? -GAGCTTCGAACAAG- - CCGTTCGAATGA ? ? HindIII酶解 HindIII酶解 ? -CTCGA- - AGCTTGTTC- - GGCA- - AGCTTACT- ? -GAGCTTCGA- -ACAAG- - CCGTTCGA- - ATGA- ? 混合退火 ? -G G C A A G C T T G T T C- ? -C C G T T C G A A C A A G- ? 切口 b、不匹配末端连接 ? -AAGCTT- -TCTAGA- ? -TTCGAA- - AGATCT ? HindIII Xba I ? -A CTAGA- ? -TTCGA T ? Klenow酶填补 ? -AAG CTAGA- ? -TTCGA TCT- ? -AAGCTAGA- ? -TTCGATCT- C.平末端连接 ? -AAGCCCGGGTCG- - GGAGGTTAACCT- ? -TTCGGGCCCAGC- - CCTCCAATTGGA ? SmaI酶切 AAGCCC-OH P-GGGTCG- - GGAGGTT-OH P-AACCT TTCGGG-P OH-CCCAGC- - CCTCCAA-P OH-TTGGA- ? 混合退火 ? OH P ? -GGAGGTT GGGTCG- ? -CC TCCAA CCCAGC 内切酶的切割方式 1.同位酶:具有相同的识别序列,但是酶切位 点不同。 SmaI(CCC↓GGG)和XmaI (C↓CCGGG),识别 序列相同,但切割位点不同,前者产生平头 末端,后者产生黏性末端它们是一对同位酶。 2.同尾酶:具有不同的识别序列,但是酶切产 物有相同的末端结构。 如BamH I(5-G↓GATCC-3)与BglⅡ (5-A↓GATCT-3)的酶切片段可以彼此连接起来 。 3.同裂酶:来自不同物种,但是识别序列和 酶切位点均相同。 ? 例如: HpaⅠ5-GTT’AAC-3;HincⅡ酶切 GTY’RAC 核酸内切酶的缓冲液性质 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、 极端pH值等, 会使一些核酸内切酶的识别 和切割序列发生低特异性,即所谓的星活 性(Star activity)现象. EcoR I在正常条件下识别并切割5’GAATTC3’ 序列,但在甘油浓度超过5%(v/v)时,也 可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’ 大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5 ’ GATC3’序列中的腺嘌呤N6 位置上引入甲基。 dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶 C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是 EcoR II。 NH2 3’-腺嘌呤脱氧核苷酸 N (3’- d AMP ) H N HO CH2 O N CH 9 N H H O O- P O H H H O NH2 OO- P O N C CH3 O O CH2 O H N HH H H OH OH 5’-胞嘧啶核苷酸 (5’- CMP ) 甲基化酶在基因工程中用途: 许多II类限制性内切酶,都存在着相对 的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序 中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从 而使其免受切割。 Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 在合适的温度和缓冲液中,在20μl反应体系 中,1 h完全降解1μgDNA所需要的酶量, 称为一个单位的限制性核酸内切酶。 酶过量可导致识别序列的特异性下降 。 应注意的问题 1浓缩的酶液要稀释(不能用水) 2 低温保存 一20℃稳定保存 影响限制性核酸内切酶活性的因素 (1).DNA的纯度 。 DNA制剂中的其他杂质,如蛋白质、酚、氯仿、 酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠(SDS) 以及高浓度的盐离子等,都有可能抑制限制性 核酸内切酶的活性。 (2).DNA的甲基化程度 。 内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列 。 通常使用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质 粒DNA。 若要使用合成的衔接物修饰DNA片段的末端, 被酶切之前,通过甲基化将内部的限制酶识别 位点保护起来。 (3)酶切反应的温度 。 大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是 37℃,但 SmaⅠ是25℃,ApaI是30℃ (4)DNA的分子结构。 超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线)限制性核酸内切酶的缓冲液。 标准缓冲液的组分包括: 氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris—HCl、β一 巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白 蛋白(BSA)等。 酶活性需要2价阳离子,通常是Mg2+。 3. DNA聚合酶 分为两类: ①依赖于DNA的DNA聚合酶,包括大肠杆菌 DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶,有逆转录酶。 DNA聚合酶 (1)大肠杆菌DNA聚合酶I (i DNA pol I): 也称为Kronberg酶,是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。 具有三种酶活性 a、5’ ---3’DNA聚合酶活性 CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGA b、3’ ---5’ 外切酶活性 CGCATCG-OH E.coli DNA pol I GCG Mg2+ dNTP CGC GCG ATCG 校正作用。 c、5’ ---3’外切酶活性 CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAG GCGTAATC Mg2+ GCGTAATC (2).Klenow酶:也称DNA聚合酶I大片段, Klenow片段或K1enow聚合酶。只是从 DNA聚合酶I全酶中去除了5’ --3’外切酶活 性。 具有5’—3’聚合酶活性; 3’—5’外切酶活性。 Klenow酶的基本用途: a.补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端 b.DNA片段的同位素末端标记 c.cDNA第二链的合成 d.双脱氧末端终止法测定DNA序列 (3)Taq DNA聚合酶 是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶,具 有5’-- 3’聚合酶活性和3’—5’外切酶活性, 需要Mg2+作辅助因子, 该酶最适反应温度为75~80℃。 主要用途是进行PCR反应。 (4) 逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶) AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒) , M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒)。 AMV逆转录酶反应的最适温度为41~45℃,最 适pH为8.3。 主要作用是将mRNA反转录成cDNA a.DNA聚合酶活性 b.RNase H活性 (特异地降解DNA:RNA杂交分子中的RNA链 ) c.DNA内切酶活性 d.DNA指导的DNA聚合活性 T4噬菌体DNA聚合酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌, 具有:5’—3’聚合酶活性 3’—5’外切酶活性, 外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA 更强。 ? 外切酶活性比Klenow酶高100~1 000倍。 可以补平或标记带3’凹陷末端的DNA分子, 可进行平头末端或3’突出末端的双链DNA的 标记。 T7噬菌体DNA聚合酶 ? 持续合成能力最强的酶。 ? 具有很强的对单链和双链DNA的3’—5’外切 酶活性. ? 主要用于催化大分子模板(如M13噬菌体)的 引物延伸反应,它可以在同一引物模板上 有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构 的影响; 测序酶 测序酶是通过化学修饰对T7噬菌体DNA聚合酶 进行改造的酶, 去除T7噬菌体DNA聚合酶的3’—5’外切酶活性, 保留聚合活性, 具有很强的持续合成能力,是Sanger双脱氧链 终止法测序的理想用酶 。 4. DNA连接酶 1967年发现。 两条DNA链之间形成磷酸二酯键。DNA ligase. Ecoli和其他细菌:能源(NAD+). 动物细胞及噬菌体:能源(ATP). 连接酶的作用是:将互补配对的两个黏性末 端连接起来,使之成为一个完整的DNA分 子。 (1). T4噬菌体DNA连接酶 不受dNTP的抑制,催化DNA片断的连接。 (2). E.coli DNA连接酶 不能连接平端DNA,不能连接RNA。78128本港台现场彩霸王在2017年10月至12月期间,。 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM ,pH 7.5 MgCl2 10 mM,ATP 0.5 - 1 mM,DTT 5 mM Volume: 10 - 20 ?l T T:4 - 15 ℃, 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性:在最佳反应条件下,15 ℃反 应1 小时,完全连接1 ?g λ-DNA(Hind III片段)所 需的酶量. 平头双链DNA片段的连接操作 粘性末端的连接属于分子内部的连接. 平头末端的连接属于分子间的连接,反应速度慢. 提高平头末端连接效率的方法包括: a.加大连接酶用量. b.加大平头末端底物的浓度,增加分子间碰 撞机会 c.加入10% PEG8000,促进大分子之间的有 效作用 d.加入单价阳离子(NaCl),www.0977744.com,最终浓度150200 mM 5. 碱性磷酸酶 去除DNA或者RNA的5’磷酸,可防止自身环 化。 5’pDNA 5’pRNA 5’OHDNA 5’OHRNA 分类: (1)BAP(bacterial alkaline phosphatase) : 细菌碱性磷酸酶,来源于大肠杆菌 。 活性高,但耐高温和去污剂,抑制其活性较难。 (2)CIP(calf intestinal alkaline phosphatase ):牛小肠碱性磷酸酶,来源于 小牛肠 。 蛋白酶K消化,EDTA参与下,65℃加热1小时 灭活。 碱性磷酸酶的主要用途有: (1)5’末端标记前的处理; (2)去除DNA片段的5’磷酸基团,防止自身 连接; 6.末端转移酶 分子量60000D,在二价阳离子的作用下,催 化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。 底物: 带3’羟基端单链DNA或带3’羟基突出端的 双链DNA。 用途: 1.载体或者cDNA加同聚尾。 2 .标记DNA3’末端。 7.核酸酶S1 S1 核 酸 酶 的 基 本 特 性 : 来 自 稻 谷 曲 霉 菌 (Aspergillus oryzae) 水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端, 产生5’–核苷酸和5’末端为p的寡核苷酸。 Zn2+必需,最适pH范围为4.0 - 4.3,需要NaCl 10 300 mM. 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍。 S1核酸酶 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核 苷酸或寡核苷酸。需要辅助因子Zn。 用途: (1) 去除DNA片断中突出的单链尾以产生平端。 (2) 打开双链cDNA合成中产生的发夹。 带切口的双链DNA S1核酸酶 8 .T4噬菌体多核苷酸激酶 催化ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5’ 末端。 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多 种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶。 用途: 1 .标记DNA或RNA5’末端。 2.对缺乏5’磷酸基团的DNA进行磷酸化或者 合成接头进行磷酸化。 9. DNase Ⅰ 从牛胰中分离到的内切酶,水解双链DNA 比单链DNA迅速,随着反应进行,双链底 物减少,单链浓度增加,反应自动减速。 酶反应的最适pH在7左右,Mg2+、 Mn 2+和 Co2+是激活剂。 10.核糖核酸酶A 特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端,切割与相 邻核苷酸形成的磷酸二酯键。 举例: 5’pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3’ 5’pApGpCp+? 5’pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3’ 5’pApGpCp+Cp +GpApApUp +GpCp +ApG RNaseU2 RNaseU2的碱基专一性与RNase A互补,特 异水解RNA链中嘌呤核苷酸的3’-磷酸基团 与相邻核苷酸的5’-OH之间的键,生成以3’嘌呤核苷酸和以3’-嘌呤核苷酸为末端的寡 核苷酸。 11.核糖核酸酶T1 一种内切核糖核酸酶。特异作用于鸟嘌呤核苷酸 3’端磷酸并切断相连的磷酸二酯键。 举例: 5’pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpApGp C 5’pApGp +Gp +? 5’pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpA pGpC 5’pApGp +Gp +CpCpGp +ApApGp +UpGp +CpApGp +C 本章小结 1 工具酶 2 限制性内切酶 3 聚合酶 4 连接酶 5 碱性磷酸酶 6 末端转移酶 7 核酸酶S1 8 T4噬菌体多核苷酸激酶 1.给你一种mRNA,按适当顺序列出从mRNA 的cDNA克隆到表达载体你所运用到的所 有酶? 答案:(1) 逆转录酶 (2)DNA聚合酶 (3)S1核酸酶 (4)限制性内切酶 (末端核苷酸转移酶) (5) DNA连接酶 思考题 1 什么是限制修饰? 2 在基因工程中应用最广泛的是 型限制性 内切酶。 3 Eco RⅠ 的识别切割序列是: 。 4 具有相同的识别序列,相同的酶切位点的 酶叫 。 5 浓缩的酶液可以用水稀释。( 6 酶切反应的温度是37℃。( 7 依赖于RNA的DNA聚合酶是 ) ) 。 8.防止DNA自身环化的酶是 。 9 能够在DNA分子的3’羟基端加dNTP的酶 是 。